应用纳米材料的医疗器械安全性和有效性评价指导原则第三部分：生物相容性/毒理学评价

本指导原则为注册申请人/监管人员提供关于应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价相关方面的信息。

本指导原则是对应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价的一般要求，注册申请人应依据具体产品的特性对注册申报资料的内容进行充分说明和细化。注册申请人还应依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述理由及相应的科学依据。

本指导原则是对注册申请人和审评人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。

一、适用范围

本指导原则适用于与人体直接或间接接触，由纳米材料组成或包含纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学评价。

不适用于：

- 应用纳米材料的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）产品；

- 应用纳米材料的赋能技术（如纳米机器人）；

- 应用纳米材料的药品；

- 应用纳米材料的医疗器械在制造和废弃过程中造成的职业和环境风险。

二、医疗器械中与纳米材料相关的风险识别和风险评估的层级评价方法

本指导原则描述的应用纳米材料的医疗器械，是指注册申请人在医疗器械产品中应用了纳米材料，且该纳米材料被设计为发挥预期功能。此类医疗器械的生物学评价应首先执行GB/T 16886系列标准文件及医疗器械法律法规的内容，再结合本指导原则描述的纳米材料特殊考虑点进行相关研究。纳米材料的安全风险与常规材料不同，主要取决于纳米材料的化学成分、物理化学性质、纳米特性、纳米结构与形貌、与组织相互作用方式以及暴露途径与水平等。相比于常规材料，纳米材料在样品制备时会有溶解性和分散性的区别，以及稳定性和均一性的要求，因此可能需要考虑纳米材料在样品制备时的特殊性；由于纳米颗粒被认为可能穿越所有生物屏障，包括血脑屏障和胎盘屏障等，因此可能需要考虑纳米材料的全身毒性，特别是中枢神经系统毒性和生殖/发育毒性；“纳米蛋白冠”的形成，可能会影响其生物响应、动力学、蓄积和毒性等生理效应；有些纳米材料具有类佐剂特性，可能会对免疫系统产生影响，需要关注免疫毒性；纳米材料被单核吞噬细胞系统清除、在特定组织器官分布、形成“纳米蛋白冠”等，可能改变其毒代动力学特征。因此，应用纳米材料的医疗器械生物学评价内容，在兼顾GB/T 16886系列标准文件中关于常规器械评价内容的基础上，重点考虑与纳米材料有关的其他问题，如样品制备，吸收、分布、代谢和排泄/清除（ADME）、中枢神经系统毒性和免疫毒性等。对应用纳米材料的医疗器械进行生物相容性/毒理学评价时，需根据GB/T 16886.1附录A中描述的生物学评价框架开展评价，并参考GB/Z 16886.22、本指导原则第三章及附件一中所描述的纳米材料特殊考虑点设计研究/试验方案。

在对应用纳米材料的医疗器械进行生物学评价时，如果纳米材料吸收和分布导致纳米材料的内部暴露、反应活性、代谢动力学或生物持久性发生改变时，可能触发进一步的试验，用于研究非常规的评价终点（如中枢神经系统、免疫系统功能终点）。

为了生成有效的毒理学数据用于应用纳米材料的医疗器械的风险识别和风险评估，更加高效地识别和评价特定风险，本指导原则提供了层级研究方法，用于逐步对应用纳米材料的医疗器械中与纳米材料相关的安全风险开展识别和评估。

层级1：注册申请人应根据医疗器械已有信息（GB/T 16886.1）和理化表征结果判断终产品中是否有纳米材料，若判断无纳米材料，则按照常规医疗器械的生物相容性/毒理学评价研究流程进行；若判断有纳米材料，则收集纳米材料的暴露可能性、表界面生物效应等信息，必要时开展纳米材料脱落和释放研究（参见本系列指导原则第二部分：理化表征）、与接触部位的表界面生物效应研究。基于所收集信息，可参考以下路径进行应用纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学评价：

（1）若无纳米材料暴露可能性且接触部位无纳米材料相关的表界面生物效应，则按照常规医疗器械的生物相容性/毒理学评价研究流程进行；

（2）若缺乏评估纳米材料暴露的可能性的方法，或难以排除暴露可能性，或试验结果证明有暴露可能性，则进行层级2的研究。

（3）若接触部位存在与纳米材料相关的表界面生物效应，则进行层级2的研究。

基于当前科学技术水平和认知，评估应用纳米材料的医疗器械中纳米材料暴露可能性和与接触部位表界面生物效应的评价方法和技术手段还不够完善，鼓励注册申请人根据应用纳米材料的医疗器械的特性，基于个案处理原则对纳米材料的脱落和释放、与接触部位的表界面生物效应进行研究，保证试验方法、检测技术等因素的可靠性，并持续更新。

层级2：对于仅在接触部位有暴露或生物效应的应用纳米材料的医疗器械，主要考察与局部效应相关的试验终点，必要时进行毒代动力学研究，考察局部组织分布特征，还应关注纳米材料向引流淋巴结迁移及进入血液引发全身效应的风险；对于有潜在全身暴露或全身效应的应用纳米材料的医疗器械，主要针对常规评价终点进行研究/试验，同时增加特殊指标的检测，考察是否有潜在的特殊毒性风险，如免疫毒性、中枢神经系统毒性等，并进行毒代动力学研究，考察主要组织器官的分布、蓄积和清除特性，来决定是否有必要进行深入研究。

层级2的步骤如下：参考GB/T 16886.1附录A选择评价终点，并按照应用纳米材料的医疗器械评价要求设计试验，具体参见本指导原则附件一。GB/T 16886.1附录A列出了一个制定生物学评价的框架，除适用于常规医疗器械外，也适用于应用纳米材料的医疗器械。但由于纳米材料或纳米结构可能引发非预期的生物学效应，若已有信息或数据证明应用纳米材料的医疗器械在某些生物学评价终点有额外的安全风险考虑点，可在层级2开展相关研究。因此，注册申请人应结合纳米材料的纳米特性及暴露特征，基于个案处理的原则，提供评价终点选择的理由，并阐述评价终点选择的科学性和合理性。

以下内容为纳米材料生物相容性与常规材料生物相容性研究差异性的举例，具体内容详见附件一：

• 细胞毒性：根据细胞摄取纳米材料的能力，以及纳米材料与细胞的相互作用模式考虑需增加的试验。采用合适的细胞来测试纳米材料在靶器官、接触部位细胞、免疫细胞的摄取及生物效应，如肝、肾为潜在靶器官时，可选择HepG2人源肝癌细胞、LLC-PK1猪肾近曲小管细胞等进行试验。
• 致敏反应：若纳米材料具备一定的透皮性或局部反应风险，仅进行GPMT试验不足以评价纳米材料的致敏反应，可考虑增加体外替代方法并验证方法的适用性，如直接肽反应性测定法（DPRA）、人细胞系激活试验（H-CLAT）、KeratinoSens和SenCeeTox等方法。
• 亚慢性全身毒性：该试验建议增加附加毒性终点相关检测指标，如生殖系统毒性、中枢神经系统毒性、免疫毒性、内分泌系统毒性等终点的相关敏感指标的检测。

慢性毒性、致癌性、生殖/发育毒性、中枢神经系统毒性、免疫毒性、内分泌干扰等附加毒性终点一般不作为层级2的首批评价终点，但需在层级2的其他试验中增加与上述终点相关的敏感指标的检测，作为是否进入层级3的依据，如在亚慢性全身毒性试验中增加中枢神经系统的功能观察组合指标的检测，考察应用纳米材料的医疗器械是否有潜在中枢神经系统毒性。

若层级2的研究结果未发现附加毒性终点相关毒性指征的改变，一般无需进入层级3的研究，而是考察层级2的研究结果是否足以进行生物相容性/毒理学风险评估，若研究结果不足以进行生物相容性/毒理学风险评估，则需修正试验条件重复层级2相关研究内容，直至完成生物学评价，或根据研究结果停止生物学评价研究。

若层级2研究结果提示明确的附加毒性终点相关毒性指征，则进入层级3的研究。这些毒性指征包括但不限于纳米材料存在消除缓慢、在特定的组织器官内有蓄积的潜力、需要更长时间的代谢数据，或毒性特征提示需要关注特定组织/器官的毒性等。此外，若已有信息或数据证明应用纳米材料的医疗器械存在生殖系统毒性、免疫毒性等安全性风险时，可考虑直接进行层级3的相关研究。

层级3：是对层级2中发现的应用纳米材料的医疗器械附加毒性终点相关毒性指征发生明显改变时，开展与毒性指征相对应的全面的特殊试验，如生殖/发育毒性试验、致癌性试验、免疫毒性试验、中枢神经系统毒性试验、或内分泌干扰试验等，参见本指导原则附件一，同时伴随相应试验开展毒代动力学研究，考察所关注的特殊组织器官中纳米材料暴露、分布和蓄积特征。注册申请人应结合纳米材料的纳米特性及暴露特征，基于个案处理的原则，提供评价终点选择的理由，并阐述评价终点选择的科学性和合理性。

完成层级3的研究后，结合层级2和层级3的研究结果考察是否足以进行生物相容性/毒理学风险评估。若层级2、层级3的研究结果足以进行生物相容性/毒理学风险评估，不必再进行其他试验；否则应重复层级2或层级3的相应研究内容，直至完成生物学评价，或根据研究结果停止生物学评价研究。

a.现有GB/T 16886.1 附录A，以及ISO/TR 10993.22（等同转化为GB/Z 16886.22）所提供的框架用于应用纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学评价是有限的，需要结合其纳米特性和暴露特征考虑增加评价终点。

b.如层级2研究结果提示应用纳米材料的医疗器械存在安全性风险，如蓄积、特定器官或系统毒性、则在层级3中针对层级2的发现进行进一步研究。如层级2中发现生殖器官有纳米材料分布，应在层级3中开展对生殖功能影响等毒性试验，并进行伴随毒代动力学，考察所关注的特殊组织器官、关键组织器官中纳米材料暴露、分布和蓄积特征。

c.如果出现以下情况，需要考虑重复进行层级2或层级3相关试验研究，如完善试验设计、试验结果存在争议、试验结果提示需要补充研究内容等。

d.完成生物学评价后，可进行产品的获益-风险评价，或者停止生物学评价，对产品重新进行研究和开发。

三、生物相容性/毒理学评价

（一）引言

对应用纳米材料的医疗器械的生物相容性/毒理学的评价包括文献综述、生物信息学、体外和体内试验等一系列研究。对于医疗器械，任何试验的选择策略均基于其预期用途/适用范围。体内研究应采用与医疗器械和/或纳米材料人体暴露途径相关的接触途径进行。所有试验均应按照现行/有效的最佳实验室/治疗规范进行，数据应由经过培训且有经验的专业人员进行分析解读。对应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价应依据以下原则：

1.进行多层级评价研究原则

应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学测试策略由其潜在外部和内部暴露特征决定。当理化表征、暴露评估等确定医疗器械有纳米材料暴露的可能性时或相关表界面生物效应时，除按照GB/T 16886系列国家标准、GB/T 42062通用要求进行相应的试验外，还应基于纳米材料风险评估的要求，参考GB/T 37129、GB/Z 16886.22，按照与纳米材料相关的风险识别和风险评估的层级评价方法流程图进行多层级评价研究，考虑是否增加额外毒性关注指标，以及深入开展附加毒性试验。

2.遵循个案处理原则

按照GB/T 16886.1的要求，医疗器械的生物学评价试验策略均应基于医疗器械分类、接触性质和暴露持续时间等进行考虑。由于应用纳米材料的医疗器械情况复杂，本指导原则不可能涵盖所有应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价的全部内容。针对某一具体产品，其生物相容性/毒理学评价应遵循个案处理的原则。

3.确认测试系统的适用性原则

纳米材料的溶解或分散状态、样品制备方法、剂量设计、细胞品系、动物种属等测试系统参数都可能影响试验结果的可靠性，故需确认测试系统是否适用于评价应用纳米材料的医疗器械，如样品制备方法不适用于应用纳米材料的医疗器械时，可考虑直接使用医疗器械终产品或代表性样品进行相关试验。目前可用于应用纳米材料的医疗器械生物学评价的专属试验方法尚在开发中，可参考的试验方法较少，已发布并正式实施的相关标准主要包括内毒素试验（YY/T 1295）、细胞毒性试验（GB/T 41212、GB/T 41915、YY/T 0993）、体外溶血试验（YY/T 1532）。因此，注册申请人应确认测试系统的适用性，提供适合所申报产品特点的生物学评价资料。一些体外试验可能对于筛选目的及作用机制的研究是有用的，但这些方法的使用必须基于个案处理原则。目前经过确认的体外方法参见欧洲替代方法验证中心（EURL ECVAM）发布的方法。

4.生物组织中纳米材料的表征原则

纳米材料和生物组织中的生物分子相互作用可能获得新“生物学特征”，即在表面吸附蛋白质等生物分子（蛋白冠、生物冠）时产生的新性质，可影响机体的生理响应及毒理学特征。因此，纳米材料在试验条件下的实际存在形式、特性和稳定性等信息对于任何试验结果的解释都是至关重要的。应在试验开始和结束时（若可行）对生物组织中的纳米材料进行表征。

5.毒代动力学数据判定原则

证明纳米材料在细胞和/或组织中有暴露是解释研究结果的关键（特别是阴性结果），缺乏这类数据对得出最终结论可能造成很大的不确定性。因此，在技术可行的情况下，应确定纳米材料是否分布在组织或细胞的特定区域，明确在试验系统中的暴露量。

（二）应用纳米材料的医疗器械生物学评价试验的核心关注点

1.样品制备

溶解和分散：纳米材料与溶解的化学物质不同，通常为不溶或部分溶解的纳米颗粒以混悬/分散和/或更大的团聚和聚集状态存在。试验介质/制剂（及其成分）可能影响纳米材料的特性和性能。当采用体内或体外方法对不溶或部分溶解纳米颗粒进行测试时，一定要重点考虑纳米材料在介质中的分散状态。

样品制备：取样和样品制备通常是整个分析过程中至关重要的步骤，也可能是结果不确定性的最大来源。纳米材料样品制备中的一个关键问题是颗粒的适当分散。目前尚无专门应对纳米材料样品制备的标准文件，注册申请人可参考GB/T 16886.12提供的样品制备通用要求进行样品制备。此外，建议注册申请人对样品制备的分散情况和稳定性进行测试并记录。

2.浓度/剂量

纳米材料浓度/剂量可能因其团聚、聚集、沉淀、与介质中的物质结合，或吸附在容器上而降低。为了确保在试验期间使用的浓度/剂量保持稳定，任何体内、体外毒性试验应特别关注纳米材料的团聚/聚集、解聚和重聚集行为，以及纳米材料的不溶/部分溶解性质，考察纳米材料在试验介质中的稳定性和均一性，以确保所用的纳米材料的浓度/剂量与预期一致。

此外，在一些试验中，使用过高的浓度或剂量可能会改变纳米材料的物理化学特性（如形成团聚体等次级粒子），导致吸收、毒性降低，甚至获得与材料固有毒性无关的结果，如吸入研究中过度负荷剂量、遗传毒性中过高浓度导致细胞毒性等。因此，申请人应提供选择高浓度或剂量的依据和理由。

3.剂量单位

常规材料通常使用重量或体积剂量单位进行检测、表示以及风险评估（例如mg/kg，或mg/L）。然而，对于纳米材料来说，潜在生物相互作用不直接依赖于分子的浓度或数量，而依赖于纳米材料/纳米物体本身。纳米毒理学的剂量-反应关系可能与纳米物体数量或表面积等纳米特征参数更相关。因此，使用比表面积、颗粒数量等剂量单位描述纳米材料的剂量-反应关系可能更加合适。也可使用纳米材料表征中得出的其他参数来表示剂量。在合适的参数识别出来之前，重要的是描述不同的剂量度量，如质量-体积浓度、颗粒数量浓度、比表面积等，为基于质量的剂量换算成其他参数提供足够的信息。

4.对试验系统的干扰

内毒素的干扰：纳米材料分散体系中存在的内毒素可能干扰试验系统，并随试验系统的不同导致假阴性或假阳性结果。

对基于光学原理试验方法的干扰：纳米材料可能与试验系统或试剂相互作用，特别是在比色试验中（例如用于细胞活性试验的磺酰罗丹明B，或MTT）。另外，一些纳米材料本身对光有散射/吸收，也可能干扰比色试验测定。这些因素需要在使用比色方法时加以考虑。

与生物分子作用：试验系统中的蛋白质/生物介质（如细胞因子）也可能吸附到纳米材料表面，造成低响应甚至是假阴性结果。

对于此类问题，建议增加合适的对照品或对现有方法进行调整。例如，纳米材料已被证明可干扰基于四唑化合物的试验，如MTS和MTT法的吸光度检测。可在读数前通过离心除去纳米材料，以降低由纳米材料产生的数据变异度。

5.可能的毒性机制

解离离子的毒性：一些金属（银）、金属氧化物（氧化锌）或无机非金属/陶瓷材料在生物介质中会（缓慢）溶解/降解，检测的部分（或全部）毒性效应可能都源于溶解/降解产生的离子。对于这类纳米材料，应在试验之前和试验期间测定溶解/降解的部分所占比例，并增加合适的离子形式对照组。

与尺寸相关的毒性：纳米材料的毒性可能源自其尺寸效应，易于进入生物系统，被炎性细胞吞噬，特别是巨噬细胞和多核嗜中性粒细胞。纳米材料可吸附蛋白质和多肽形成新的蛋白质复合物，或改变蛋白质结构，促进蛋白质降解，触发炎性细胞的应答过程。因此，应关注尺寸效应与毒性的相关性，以进行风险评估。

纳米材料形貌对吞噬作用的影响：纳米材料的软硬度、刚性、拓扑结构对细胞摄取、细胞内定位、细胞内吞机制均具有影响。例如，球状纳米颗粒被细胞内吞的过程比棒状或纤维状纳米材料容易和迅速。对于这类纳米材料，应关注不同纳米形貌结构对细胞摄取与毒性的影响。

（三）生物相容性/毒理学试验

本指导原则旨在为经过培训的专业人员提供在医疗器械评价方面对应用纳米材料的医疗器械进行生物相容性/毒理学评价的通用方法，并在附件一中讨论如何基于GB/T 16886系列标准文件、GB/Z 16886.22，及应用纳米材料的医疗器械特殊考虑点来设计试验，包括试验设计、细胞/动物模型选择、研究终点选择、结果解释等内容。

本指导原则代表了现有认知水平下监管部门对应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价终点的考虑及应对措施，未来随着毒理学和纳米材料转归方面的认知增长，更多试验方法的缺陷可能会显现出来，本指导原则的内容将随着纳米材料生物相容性/毒理学评价研究的不断推进而完善。因此，建议注册申请人关注研究最新进展，并在开展应用纳米材料的医疗器械生物相容性/毒理学评价时加以考虑，以保持对应用纳米材料的医疗器械生物学评价最新技术的持续更新。